AIRC 5x1000 staminali

Un programma speciale di oncologia clinica molecolare

La facility di fosfoproteomica

Picture4La messa a punto di una terapia personalizzata per il singolo individuo richiede un’approfondita conoscenza delle vie di trasduzione del segnale (pathway) attive nelle sue cellule tumorali, che insieme definiscono il profilo molecolare del paziente. Sulla base di questo quadro diviene possibile una scelta efficace della combinazione di farmaci a bersaglio molecolare da utilizzare contro la neoplasia.

Per poter identificare le pathway attive e la loro rilevanza nel processo tumorigenico, è necessario individuare e quantificare l’espressione delle proteine corrispondenti, siano esse i recettori che danno avvio alla cascata di reazioni oppure gli intermedi di quella pathway.

Per fare questo, è utile ricorrere a una tecnica chiamata Reverse Phase Protein Lysate Microarray (RPPM), o più semplicemente fosfoproteomica. La RPPM è una tecnica di indagine molecolare che permette l’analisi simultanea dei livelli di espressione di diverse proteine target su un larghissimo numero di campioni, siano essi lisati cellulari (soluzioni ottenute dalla rottura o “lisi” delle cellule) o fluidi corporei.


imgfp-3La procedura prevede che piccole porzioni di campione siano immobilizzate in minuscole celle (spot) su una matrice (slide o array), che viene poi incubata con specifici anticorpi diretti contro la proteina target, in grado di evidenziarne l’espressione attraverso un segnale colorimetrico, chemioluminescente o fosforescente. “Spottando” porzioni dello stesso campione in molte matrici con anticorpi diversi, poi, è possibile visualizzare l’espressione di diverse proteine simultaneamente. Le diverse fasi del procedimento sono illustrate di seguito.

La RPMM si presta a numerose applicazioni, dall’analisi dell’espressione di proteine in cellule, fluidi corporei o tessuti, all’indagine delle vie di segnale intra o intercellulari, al monitoraggio delle modificazioni del proteoma prodotte in risposta a stimoli fisici o chimici. Introdotta per la prima volta da Lance Liotta ed Emanuel Petricoin nel 2001, questa tecnica è stata applicata per molti anni alla sola ricerca scientifica di base, e a partire dal 2008 viene comunemente utilizzata nei trial clinici come strumento diagnostico, per la formulazione prognostica o come guida nella scelta terapeutica. Rispetto ad altre tecniche con analoghe finalità, come il western blotting e l’ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, saggio immuno-assorbente legato ad un enzima), la RPPM ha il vantaggio di permettere l’analisi simultanea di migliaia di campioni con lo stesso anticorpo in un singolo esperimento, e con una sensibilità di gran lunga superiore, grazie alla ridotta dimensione dei pozzetti, che incrementa notevolmente l’intensità del segnale per unità di superficie. Il principale limite di questa tecnica è quello di richiedere l’utilizzo di anticorpi altamente specifici, che devono essere individuati e accuratamente selezionati attraverso una fase di screening preliminare tramite western blotting.

Picture1La facility di fosfoproteomica è stata allestita all’Istituto Superiore di Sanità, nella sede di via Giano della Bella, insieme alla Biobanca ISS. L’obiettivo di questa facility e del gruppo di ricerca che vi lavora è quella di ricostruire, attraverso l’analisi delle linee di cellule staminali tumorali (CSC, Cancer Stem Cells) isolate alla Biobanca e dei campioni di tessuto dei pazienti reclutati nel Progetto, l’insieme delle principali pathway attive. I profili di espressione ottenuti saranno utili a individuare i meccanismi alla base della sensibilità/resistenza dei pazienti verso alcune terapie a bersaglio molecolare, attualmente somministrate in maniera aspecifica con esiti contrastanti. Identificare il profilo molecolare corrispondente alla sensibilità verso un determinato farmaco significa essere in grado di somministrare la terapia solo agli individui che possono trarne realmente un beneficio, risparmiando a tutti gli altri inutili effetti collaterali. La finalità ultima dell’analisi fosfoproteomica è però la terapia personalizzata. Attraverso una profonda conoscenza del ruolo delle diverse vie di trasduzione del segnale nell’insorgenza e sviluppo del tumore, delle strategie per bloccare selettivamente le pathway di interesse, e divenuto in grado di definire una mappa delle vie di trasduzione attive nelle CSC del paziente (il già citato profilo molecolare), sarà possibile per l’oncologo mettere a punto un protocollo di terapia personalizzato, costituito dalla combinazione di farmaci in grado di bloccare le sole pathway tumorigeniche di ciascun individuo.